多聚酶链式反应扩增DNA片段

多聚酶链式反应扩增DNA片段

教学目标：
（一）知识与技能
1、了解pcr技术的基本操作
2、理解pcr的原理
3、讨论pcr的应用
（二）过程与方法
在多聚酶链式反应扩增dna片段的实验过程中，应避免外源dna污染，严格控制温度等反应条件
（三）情感、态度与价值观
通过对pcr实验的操作及结果分析，培养学生严谨的科学态度和实事求是的科研精神
教学重点：pcr的原理和pcr的基本操作
教学难点：pcr的原理
教学过程：
（一）引入新课
在现代生物技术中，dna技术可谓是尖端技术。人类基因组计划、基因工程、基因诊断、基因检测、古生物鉴定等都离不开对dna分子碱基序列的分析。而分析dna碱基序列，就需要一定量的dna片段。怎样迅速获得足够量的dna片段呢？今天我们来研究学习dna分子的扩增技术――pcr技术。
（二）进行新课
1.基础知识
pcr技术扩增dna的过程，与细胞内dna复制过程类似：
1.1细胞内dna复制条件分析：
条件 组分 作用
模板 dna的两条单链 提供复制的模板
原料 四种脱氧核苷酸 合成dna子链的原料
酶 解旋酶
dna聚合酶 打开dna双螺旋
催化合成dna子链
能量 atp 为解螺旋和合成子链供能
引物 rna 为dna聚合酶提供合成的3’端起点
1.2细胞内dna复制过程
（1）dna的反向平行结构：（结合投影图）
核苷酸分子的结构与方向性：（分子结构模式图）
由核苷酸通过3,5-磷酸二酯键连接形成核苷酸长链：（模式图，体现方向性）。
dna双螺旋结构的反向平行结构：
（2）dna的复制过程:
解    旋：解旋酶、atp，dna两条链打开，，形成两条dna单链。
引物结合：在dna单链3’端与dna反向配对结合，确保引物3’端与dna单链准确配对。
dna聚合酶结合：
子链合成：dna聚合酶从引物3’端开始，将配对的脱氧核苷酸连接起来。
后续加工：dna聚合酶i将引物切去，并合成空缺处的dna单链，再由dna连接酶将不连续的dna子链连接起来（半不连续合成。先导链，滞后链）
子链合成特点：不能从头合成；合成方向为“5’→3’合成”。
感悟生命的神秘：dna聚合酶不但能够催化磷酸二酯键的形成，还具有校对功能。它在每引入一个核苷酸后都要复查一次，只有碱基配对无误后才能继续往下聚合，它不能从头合成。rna聚合酶没有校对功能，因此rna的合成不需要引物，而是从头合成的，它的错配可能性较大，在rna引物完成功能后即被dna聚合酶i删去，代之以高保真的dna链。
［思考］dna分子能准确复制的原因有哪些？
dna双螺旋结构提供模板；碱基互补配对；dna聚合酶的复查功能。
［思考］细胞内哪些物质是从头合成的？rna合成、蛋白质合成。
1.3dna分子复制的人工控制
解开螺旋：在80～100℃时，dna双螺旋打开，形成两条dna单链，称为变性。
恢复螺旋：在50℃左右时，两条dna单链重新形成双螺旋结构，称为复性。
复制条件：缓冲液,dna模板,四种脱氧核苷酸,热稳定dna聚合酶,两种引物。
反应场所：pcr仪（自动温度周期性调节）。
［思考］缓冲液相当细胞内的什么成分？（核基质）1.4pcr的反应过程

变性：在95℃时dna解旋
复性：在50℃时引物与dna单链结合
延伸：在72℃时合成dna子链（两个引物间的序列）2.实验操作
2.1 pcr反应体系：缓冲液、dna模板，四种脱氧核苷酸原料、热稳定dna聚合酶、两种rna引物，水