6.2 DNA片段的扩增——PRC技术

6.2 DNA片段的扩增——PRC技术

★课题目标（一）知识与技能1、了解pcr技术的基本操作2、理解pcr的原理3、讨论pcr的应用

   （二）过程与方法

　　在多聚酶链式反应扩增dna片段的实验过程中，应避免外源dna污染，严格控制温度等反应条件（三）情感、态度与价值观    通过对pcr实验的操作及结果分析，培养学生严谨的科学态度和实事求是的科研精神★课题重点pcr的原理和pcr的基本操作★课题难点  　pcr的原理★教学方法    启发式教学 ★教学工具    多媒体课件★教学过程 （一）引入新课在现代生物技术中，dna技术可谓是尖端技术。人类基因组计划、基因工程、基因诊断、基因检测、古生物鉴定等都离不开对dna分子碱基序列的分析。而分析dna碱基序列，就需要一定量的dna片段。怎样迅速获得足够量的dna片段呢？今天我们来研究学习dna分子的扩增技术――pcr技术。（二）进行新课1.基础知识pcr技术扩增dna的过程，与细胞内dna复制过程类似：1.1细胞内dna复制条件分析：条件组分作用模板dna的两条单链提供复制的模板原料四种脱氧核苷酸合成dna子链的原料酶解旋酶dna聚合酶打开dna双螺旋催化合成dna子链能量atp为解螺旋和合成子链供能引物rna为dna聚合酶提供合成的3’端起点1.2细胞内dna复制过程（1）dna的反向平行结构：（结合教材图5－6）核苷酸分子的结构与方向性：（分子结构模式图）由核苷酸通过3,5-磷酸二酯键连接形成核苷酸长链：（模式图，体现方向性）。dna双螺旋结构的反向平行结构：（2）dna的复制过程:解    旋：解旋酶、atp，dna两条链打开，，形成两条dna单链。引物结合：在dna单链3’端与dna反向配对结合，确保引物3’端与dna单链准确配对。dna聚合酶结合：子链合成：dna聚合酶从引物3’端开始，将配对的脱氧核苷酸连接起来。后续加工：dna聚合酶i将引物切去，并合成空缺处的dna单链，再由dna连接酶将不连续的dna子链连接起来（半不连续合成。先导链，滞后链）子链合成特点：不能从头合成；合成方向为“5’→3’合成”。感悟生命的神秘：dna聚合酶不但能够催化磷酸二酯键的形成，还具有校对功能。它在每引入一个核苷酸后都要复查一次，只有碱基配对无误后才能继续往下聚合，它不能从头合成。rna聚合酶没有校对功能，因此rna的合成不需要引物，而是从头合成的，它的错配可能性较大，在rna引物完成功能后即被dna聚合酶i删去，代之以高保真的dna链。［思考］dna分子能准确复制的原因有哪些？dna双螺旋结构提供模板；碱基互补配对；dna聚合酶的复查功能。［思考］细胞内哪些物质是从头合成的？rna合成、蛋白质合成。1.3dna分子复制的人工控制解开螺旋：在80～100℃时，dna双螺旋打开，形成两条dna单链，称为变性。恢复螺旋：在50℃左右时，两条dna单链重新形成双螺旋结构，称为复性。复制条件：缓冲液,dna模板,四种脱氧核苷酸,热稳定dna聚合酶,两种引物。反应场所：pcr仪（自动温度周期性调节）。［思考］缓冲液相当细胞内的什么成分？（核基质）4.pcr的反应过程

变性

复性

延伸
变性：在95℃时dna解旋复性：在50℃时引物与dna单链结合延伸：在72℃时合成dna子链（两个引物间的序列）2.实验操作2.1 pcr反应体系：缓冲液、dna模板，四种脱氧核苷酸原料、热稳定dna聚合酶、两种rna引物，水2.2 实验操作步骤2.3 按照pcr反应体系配方配制反应液；（2）将pcr反应体系50μl用微量移液器转移到微量离心管（0.5ml）中；（3）将微量离心管放到pcr仪中；（4）设置pcr仪的工作参数。（5）dna在pcr仪中大量扩增。2.4 水浴法：将微型离心管依次在95℃、55℃、72℃的恒温水浴锅中循环处理相应时间。3.实验注意事项3.1避免外源dna污染：所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前高压灭菌。3.2缓冲液和酶分装成小份，－20℃低温保存。3.3每添加一种反应成分，更换一个移液器的枪头。3.4混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。4.结果分析与评价4.1反应液稀释：取2µlpcr反应液，添加98µl蒸馏水；2.分光光度计调零：将100µl蒸馏水添加到比色杯中，在260nm处将分光光度计调整读数为零。4.2将100µl反应稀释液倒入比色杯中，测定在260nm处的光吸收值。4.3计算：dna含量＝50×光吸收值×稀释倍数（三）课堂总结、点评